乙肝病毒基因分型悬液芯片检测方法建立及初步应用

　　乙型肝炎(以下简称"乙肝")是一种严重危害人类健康的传染病, 病原体是乙肝病毒 (hepatitis Bvirus,HBV). 据估计全世界有4 亿 HBV 感染者,约3/4 在亚洲[1]. HBV 感染已成为我国最严重的公共卫生问题之一, 我国有 60%的人曾感染过 HBV,9.8%的人为 HBV 携带者,每年约 26 万人死于因 HBV 感染引起的肝癌或肝硬化,占世界范围内因 HBV 感染而死亡人数的 37%~50%[2]. 乙肝也一直是出入境检验检疫部门重点监测的传染病之一.

 

　　作为 HBV 的主要包膜蛋白, 乙肝表面抗原(HBsAg) 有 不同抗原性 , 可被分为 9 个 血清型(HBsAg 亚 型 ):adw2、adw4、ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、adrq-、adrq+和 ayr. 但血清型不能充分反映 HBVDNA 序列的具体差异,即血清型不能反映基因组的差异,同一血清型可以分布于不同的基因型中,而不同的血清型也可属于同一基因型[3]. 按照 HBV 基因组序列异质性>8%或 S 基因差异>4%的分型原则,已公认的有 A~H 共 8 个基因型[4-5]. 近年又发现的新基因型为 I型[6-7]和 J 型[8]. 不同基因型 HBV 有不同的致病性和不同的病毒学特性[9],而且基因分型也有助于病情评估、治疗药物选择和预后判定,且为病毒变异、 发病机制的探讨和分子流行病学研究提供参考依据[10-13].目前 HBV 基因分型的方法众多,但这些方法或多或少存在一些缺陷, 悬液芯片技术在多重单核苷酸多态性和病原微生物多重检测方面应用更成熟[18-20],已被广泛应用于基因组学和蛋白组学的诸多研究领域[21-24]. 本研究建立 HBV 基因分型的悬液芯片检测方法, 在采样当天即可通过 1 次检测实现 8 种基因型的快速检测,大大提高了检测效率,既可对大量样本进行同时检测,亦可实现多种基因型的同时筛查.

 

　　1 材料与方法

 

　　1.1 质粒 分别构建包含 8 种基因型靶标基因的质 粒 PMT-HBV -A、PMT-HBV -B、PMT -HBV -C、PMT -HBV -D、PMT -HBV -E、PMT -HBV -F、PMT -HBV-G、PMT-HBV-H,化学合成的寡聚核苷酸由英潍捷基(上海)有限公司合成,并通过 PCR 的方法拼接 , 并 将 合 成 好 的 序 列 克 隆 入 pMD18-T 载 体(Takara 产品).

 

　　1.2 引物与探针的设计[25]选取 GenBank 上不同国家或地区的 8 种基因型 HBV 的保守序列, 利用DNA Star(V 5.06)分别找出各基因序列中的最保守寡核苷酸序列作为设计反转录引物、PCR 引物及探针依据. 下游引物的 5′端标记生物素(Biotin),探针的 5′端 C12 标记氨基(NH2),引物和探针均由上海生工合成(表 1).

 

 

　　1.3 多重PCR 扩增及悬液芯片检测方法的建立[25]

 

　　1.3.1 核酸提取 使用德国 Qiagen 公司的血液/组织DNA 提取试剂盒,按说明书操作.

 

　　1.3.2 多重 PCR 扩增 PCR 扩增体系为 20 μl,包括 10×PCR 缓冲液 2μl,2.5mmol/L dNTPs 2μl, 5U/μlTaq 酶 0.07 μl,上 游引物 (5 μmol/L) 0.3 μl,下 游引物(5 μmol/L) 1.5 μl,模板 DNA 1 μl,用无菌去离子水补至 20 μl. PCR 反应程序:94℃ 5 min;94℃30 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s,40 个循环;72℃ 10 min.同时设阴性对照以水代替样品模板, 阳性对照以含有检测序列的 DNA 作为模板.

 

　　1.3.3 杂 交及信号标记 取 10 μl 多 重 PCR 扩 增产物,按照文献的方法[25]杂交,获得微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE 的复合物.

 

　　1.3.4 检测 使用 Bio-Plex 200 对 1.3.3 的复合物进行检测,先对检测到的每种微球进行计数,每种微球的计数值≥50 个认为检测结果有效. 再以每种病原体特异性核酸探针微球的阴性对照杂交检测所得的平均荧光信号值(MFIs)作为背景值,对应待检样本的 MFIs≥相应背景值的 2 倍以上则判定标本该种病毒检测结果为阳性,<2 倍为阴性[26].

 

　　1.4 重复性、 特异性实验 为了确认 PCR 反应体系中各对引物检测的特异性, 将构建的 8 个质粒进行混合(质粒 DNA 浓度为 9×102DNA 拷贝,各质粒DNA 的浓度比例为 1 ∶ 1), 分别与指定引物进行扩增,电泳验证扩增条带是否符合各目的片段的大小、是否有交叉扩增. 将 PCR 扩增产物与 8 种基因探针偶联的相应荧光编码微球进行杂交, 在相同的实验条件下,先后重复检测 3 次,根据 MFIs 的变异系数(CV)验证方法的特异性和重复性.

 

　　1.5 敏感性实验 将 8 个重组质粒 DNA 定量,10倍稀释成 3×10-1ng(9×106DNA 拷贝)~3×10-8ng(0.9DNA 拷贝). 按照 1.3 的方法进行多重PCR 扩增及悬浮芯片检测.

 

　　1.6 检测方法的初步应用 对本实验室保存的 83份病例血清样本(其中大三阳 75 份,小三阳 8 份)和20 份健康人血清样本, 提取 DNA 用建立的方法进行检测. 同时与荧光 PCR 方法(上海之江)进行比对,评价其可靠性及临床实用性.

 

　　2 结 果

 

　　2.1 PCR 条件优化 生物素修饰引物与无修饰引物间比例为 5 ∶ 1(对应 PCR 反应体系中引物的终浓度分别为 0.5 μmol/L 与 0.1 μmol/L) 时获得的产物杂交荧光信号最强.

 

　　2.2 特异性和重复性实验 将构建的 8 个 质粒混合,分别与相应引物进行 PCR 扩增. 电泳显示扩增条带均符合各目的片段的大小(图 1).

 

 

　　混合质粒分别经 PCR 扩增后,与微球探针组进行杂交检测,8 种基因型检测无交叉反应 (表 2),建立的悬液芯片检测方法具有较好的特异性. 另外对质粒混合样本与混合引物应用所建立的方法, 在相同的实验条件下,先后重复检测 3 次,CV 均在 5%以内,表明该方法具有良好的重复性(表 3).

 

 

　　2.3 敏感性实验 将 8 种质粒 DNA 进行 10 倍浓度稀释后,按照建立的方法进行扩增、杂交检测,结果见表 4. HBV-A、HBV-E、HBV-G 检测敏感性约为 9 DNA 拷贝 (3×10-7ng);HBV-B、HBV-C、HBV-D、HBV-F、HBV-H 检 测敏感性约为 90 DNA 拷 贝(3×10-6ng). 同时,阴性对照信号值相对较低,与阳性样本的杂交信号间有较大差别, 可以阴性对照荧光信号值作为本底信号.

 

 

　　2.4 方法的初步应用 用建立的方法检测本实验室保存的健康人和乙肝病人血清样本,检出HBV-B型 10 份,占 12.05%(10/83),HBV-C 型 71 份,占85.54%(71/83),HBV-CD 混合型占2.41%(2/83),其余基因型未检出. 20 份健康人血清全部为阴性. 而荧光 PCR方法对 3 份样本未能分型, 而悬液芯片方法检测均为 C 型(表 5),其他结果均相同.

 

　　将悬液芯片的检测结果与荧光 PCR 检测结果进行比较,两方法配对 χ2检验结果表明两方法差异无统计学意义 (χ2=3.00,P=0.083),Kappa 检验结果(Kappa=0.941,P < 0.001)提示两方法高度一致. 以荧光 PCR 为标准,对 HBV 各基因型进行分析得出,灵敏度为 100%, 特异度为 86.97%, 假阳性率为13.03%,假阴性率为 0.00%,阳性预测值为96.36%,阴性预测值为 100%.

 

　　3 讨 论

 

　　本研究利用悬液芯片检测技术平台, 建立了针对 HBV 8 个基因型的检测方法, 较免疫学方法,消除了检测病原体时可能存在的交叉反应的干扰[27];较荧光 PCR,增加了检测通量. 为了验证方法的可行性,本研究通过构建 8 个基因型的阳性质粒 DNA检测方法的特异性, 即采用不同质粒组合分别与混合引物进行扩增, 以及混合质粒与特定引物进行扩增两种方式.

 

　　本研究在优化 PCR 条件环节, 采用了不对称PCR 替代普通 PCR. 两种方法耗时相同,但前者的优势在于, 对同样浓度的标本, 不对称 PCR 可使目的DNA 单链的产量得到提高,从而有效降低悬浮芯片杂交时互补 DNA 链的竞争性抑制效应,使获得的产物杂交荧光信号最强[28].检测敏感性可达到 9~90 DNA拷贝,高于商品化荧光 PCR 分型试剂(1000 拷贝/ml).

 

　　虽然检测过程比荧光 PCR 费时(约多 1~2 h),但对同一样本多指标同时检测时悬液芯片技术更有优势,在同一试管中, 一次就可进行多达 100 种探针的检测与分型,具有容易判读、记录及储存检测结果的优点. 在质量控制方面, 检测时先对检测到的每种微球进行计数,当计数值≥50 个则认为该检测结果有效. 另外,通过设置阳性质粒控制假阴性,设置阴性对照控制非特异性. 由于悬液芯片检测存在着不同次实验之间的整体荧光信号值的差异, 因此将阴性对照的 MFIs 值作为背景信号, 该信号的强弱受荧光染料及染色时间等的影响. 在确定阳性阈值时,以每次检测阴性对照 MFIs 值的 2 倍作为结果判断的依据,避免了检测过程中非特异性干扰.

 

　　利用本研究建立的悬液芯片法对 83 份病例血液样本和 20 份健康人样本进行分型,病例样本中共检出 HBV-B、HBV-C、HBV-C/HBV-D 混合型,其余基因型未检出;20 份健康人样本检测全部为阴性.而市售荧光 PCR 检测试剂盒对 3 份样本未能分型,而悬液芯片方法检测均为 C 型,其他结果均相同. 由于样本数量有限,没有更多基因型的样本用于验证,还需在今后样本数量足够的情况下做进一步的验证.本研究建立的悬液芯片检测 8 个 HBV 基因型的方法,具有高敏感性及特异性,只需 1 次 PCR,就能同时检测多个基因型. 既适合大样本筛查, 也适合个体多指标差异识别, 其检测结果可为临床检测和快速筛查提供了一种新的技术手段, 将在流行性疾病暴发和临床诊断中发挥重要作用.

 

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