结核菌快速检测技术进展

　　内容提要：结核菌都是利用传统涂片镜检方法来予以检测，存在着较大的问题：培养时间需要60~90d,且检出率不到35%,给结核菌的诊断与治疗带来了较大的困难，因此，医学界亟待出现结核菌快速检测技术，本文分别从液体培养技术、固体培养技术、硝酸盐还原酶测定（NRA）技术等方面深入探讨了结核菌快速检测技术进展，具有一定的参考价值。
　　
　　关键词：结核菌；快速检测；技术
　　
　　1.前言
　　
　　从目前来看，结核病的发病率在最近几年内呈现出较为明显的上升趋势。据世界卫生组织的统计数据来看，全球有超过20亿人不同程度感染了结核，并且每年还会出现890万新发结核菌病例，还有160万结核菌患者死亡[1].我国也是结核病高发国，发病人数居于全球第二，仅次于印度，每年会出现145万新发结核菌病例，还有20万结核菌患者死亡[2].通常而言，结核菌都是利用传统涂片镜检方法来予以检测，存在着较大的问题：培养时间需要60~90d,且检出率不到35%[3],给结核菌的诊断与治疗带来了较大的困难。国外内医学界已经越来越重视结核菌快速检测技术，希望能够通过结核菌快速检测技术来提高结核菌的诊断率，以此达到尽快治疗的效果。本文就结核菌快速检测技术进行进展。
　　
　　2.液体培养技术
　　
　　在液体培养基中，结核杆菌的生长速度较快，且液体培养仅需要简单的操作设备即可，方法原理简单，世界卫生组织大量鼓励全球中低收入国家采用液体培养方法。
　　
　　（1）分枝杆菌快速手工培养技术
　　
　　将荧光指示器镶嵌在肉汤培养基试管底部，若指示器发出橙色荧光，那么就说明存在着结核菌，通过对比含抗结核药管与生长对照管的荧光情况就可获得细菌药敏情况与生长情况。分枝杆菌快速手工培养技术检测精确（检出率高于90%），方法有效、简单，只需7~14d就可得到检测结果[4].
　　
　　（2）The BACTEC MGIT960自动培养技术
　　
　　The BACTEC MGIT960自动培养技术的检测原理与分枝杆菌快速手工培养技术相似，但需要由仪器来自动控制荧光信号的读取，但是其最大的问题在于：一次性设备投入较大，应用面较窄[5].
　　
　　（3）The Bac T/Alert 3D系统技术
　　
　　The Bac T/Alert 3D系统技术采用改良7H9 Middlebrook肉汤培养基，将比色传感器镶嵌在试管底部，试管对二氧化碳（由细菌代谢产生）的检测灵敏度较高，试管颜色的变化可通过The Bac T/Alert 3D系统技术来予以24h实时持续检测，待试管的颜色变为黄色之后，那么说明确实存在着结核菌。The Bac T/Alert 3D系统技术的检测特异度与检测灵敏度均较佳，尤其适用于快速培养结核菌的过程中，但对二线药敏试验报道不足。
　　
　　（4）The Versa TREK系统技术
　　
　　The Versa TREK系统技术采用7H9 Middlebrook肉汤培养基，通过培养容器内部的压力变化情况来对细菌的生长情况予以实时掌握，无论是检测过程，还是培养过程，均在同一培养容器中完成，但是目前国内外对于The VersaTREK系统技术的应用报道较少，还有待于在临床上深入评估其实用性[6].
　　
　　（5）载玻片培养技术
　　
　　首先，在灭菌载玻片一端放置十个样品涂片，然后，再纵向切割玻片为两半，分别放入液体培养基培养瓶内，其中将3瓶不含抗结核药的培养瓶作为对照组，将含抗结核药的培养瓶作为药敏试验组，培养24h候后再去除对载玻片进行固定干燥。只要有菌落出现在药敏组中，那么就可以将其视为耐药。载玻片培养技术的结果明确，培养原理简单，但是安全性较差、操作繁杂。
　　
　　3.固体培养技术
　　
　　（1）TK培养基结核菌快速培养技术
　　
　　培养基颜色会随着结核杆菌的代谢活动予以变化，可基于培养基的颜色来判断分枝杆菌是否生长。比常规培养技术相比，TK培养基结核菌快速培养技术的检测时间会缩短10d,并且还能够将常见的细菌污染予以排除，经济可靠、原理简单。
　　
　　（2）噬菌体法检测结核杆菌技术
　　
　　噬菌体法检测结核杆菌技术的检测过程只需要3d,与涂片染色相比，其诊断敏感性略高一些，但是诊断敏感性比不上传统培养法，可将其用于休眠期结核杆菌、活动期结核杆菌的检测。
　　
　　4.硝酸盐还原酶测定（NRA）技术
　　
　　检测原理：硝酸盐在结核杆菌的作用下会转变成为亚硝酸盐，这样一来，就会导致试剂的颜色出现变化。硝酸盐还原酶测定（NRA）技术是一种快速药敏试验方法，不仅价格便宜，而且还可用于检测痰标本，测试利福平的敏感度为94%~100%,特异度为94%~100%;测试异烟肼的敏感度大于92%,特异度也大于92%;测试链霉素的敏感度为100%,特异度为100%;测试乙胺丁醇的敏感度为93%,特异度为100%,检测时间最长为23d.
　　
　　E实验：E实验是一种快速药敏实验方法，能够对多种药物进行同时测试，但容易受到其他因素的污染和影响，较易出现较高的阴性率与假阳性率，会导致检测费用大幅度增加，技术有待改进。
　　
　　5.核酸扩增技术
　　
　　临床上对分枝杆菌种类进行鉴定的主要方法一直以来都是生化方法，不仅费时繁琐、费时，而且还很难得到较为精确的检验结果。而后出现的Accuprobe试剂盒能够对临床标本进行直接鉴定，能够利用DNA探针来对堪萨斯分枝杆菌、复合结核杆菌、胞内分枝杆菌、鸟结核分枝杆菌、戈登氏分枝杆菌等进行直接辨别，安全可靠。
　　
　　6.Gene Xpert技术
　　
　　Gene Xpert属于快速PCR检测方法，主要优点在于诊断试剂盒和检测系统的独特设计以及两者之间完美结合。工作人员只须按照配比将痰标本与处理液混合，静置10min,然后再将混合液体滴入反应盒，再放入检测模块中，即完成手工操作过程。等待大约2h,检测报告就可以打印出来。与传统意义上的PCR设计不同，Gene Xpert采用的是gene Xpert全封闭、全自动化的PCR检测平台，采取独特的模块设计，每个模块都集成有独立的检测系统。
　　
　　参考文献
　　
　　[1]赵建宏，李雅静，温海楠，等。非结核分枝杆菌感染的分子诊断研究进展[J].检验医学， 2012,18（3）：120-125.
　　[2]代旭磊，柳爱华，宝福凯，等。结核分支杆菌的分子检测技术研究进展[J].现代预防医学， 2012,19（8）：110-114.
　　[3]张朝宝，王洪海，张舒林。结核分枝杆菌最低抑菌浓度测定方法及临界值设置研究进展[J].上海交通大学学报（医学版），2012,30（5）：130-135.
　　[4]陈曼，胡启飞，祝绚，等。肺结核快速检测技术对肺结核的早期诊断[J].中华实用诊断与治疗杂志， 2010,18（3）：141-146.
　　[5]Devasia1 RA, Blackman A, May C, et al. Fluoroquinolone resistancein Mycobacterium tuberculosis:an assessment of MGIT 960,MODSand nitratereductase assay and fluoroquinolone cross-resistance[J]. J Antimicrob Chemother, 2009,63（6）：1173-1178.
　　[6]Bwanga F, Haile M, Joloba ML, et al. Direct nitrate reductase assayversus microscopic observation drug susceptibility test for rapid detec-tion ofMDR-TB in Uganda[J]. Plos One, 2011,50（3）：109-115.