法舒地尔对造影剂诱导急性肾损伤的保护作用

　　[摘要]目的 造影剂诱导的急性肾损伤是临床常见并发症。文中探讨法舒地尔通过抑制Rho/ROCK信号通路改善肾血流动力学障碍、抑制细胞凋亡等肾保护作用。方法 选取40只BALB/C野生型小鼠行单侧肾蒂结扎术。术后1周按照随机数字表法分为4组（n=10）：对照组、注射碘克沙醇诱导的造影剂肾病模型组（CM组）、低剂量法舒地尔干预组（LD组）和高剂量法舒地尔干预组（HD组）。CM、LD和HD组小鼠按4.0gI/kg剂量经尾静脉注射碘克沙醇注射液，对照组小鼠注射等剂量的等渗盐水。分别于注射碘克沙醇前12、2h以及注射后4h的3个时间点，按高剂量10mg/kg和低剂量3mg/kg予HD和LD组小鼠腹腔注射法舒地尔注射液。造模后24h分别检测各组小鼠肾动脉血流量、血清及尿液肾功能标志物、肾组织形态学变化以及细胞凋亡相关蛋白的表达水平。结果 与CM组尿液β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶水平[（21.82±2.07）U/L]相比，LD与HD组均显着降低，分别为[（14.89±1.48）U/L]和[（15.71±2.24）U/L].HD组较CM组组织切片TUNEL染色阳性细胞百分比显着降低[（30.79±1.30）%vs（65.74±2.20）%,P<0.05].同时HD组较CM组抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平上调，右肾动脉血流量增加[（1.22±0.07）vs（0.07±0.05）],血清肌酐[（26.41±1.83）μmol/Lvs（65.04±4.89）μmol/L]、尿素氮水平[（6.86±0.45）mmol/Lvs（14.11±1.44）mmol/L]及PAS染色肾小管损伤评分[（1.20±0.20）vs（3.71±0.18）]均降低，差异有统计学意义（P<0.05）。LD组干预后虽然在血清肌酐、尿素氮、肾小管损伤评分、肾血流量等指标中也表现出肾保护作用；但与CM组间比较，差异无统计学意义（P>0.05），且TUNEL染色阳性细胞百分数、Bax、ROCK-2和pMYPT-1蛋白表达水平与CM组间差异亦无统计学意义（P>0.05）。此外，与CM组相比，高剂量法舒地尔抑制ROCK-2和pMYPT-1信号，并显着降低凋亡相关蛋白Bax表达水平。结论 法舒地尔可以改善造影剂诱导的血清肌酐、尿素氮升高以及肾结构损伤，其肾保护作用机制主要与抑制Rho/ROCK信号通路、减少细胞调亡以及扩张血管密切相关。
　　
　　[关键词]造影剂肾病；法舒地尔；凋亡；血管扩张
　　
　　0引言
　　
　　法舒地尔是一种特异性的Rho激酶抑制剂，临床上多用于缓解蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛，改善脑组织微循环，促进神经再生。研究表明，法舒地尔具有介导血管平滑肌舒张、扩张血管的作用[1].法舒地尔无论是在体内或是体外试验中均可扩张肾入球小动脉和出球小动脉，且对前者的扩张作用略大于后者[2].与此同时，法舒地尔还可以逆转血管紧张素Ⅱ等缩血管因子对肾动脉的收缩作用。因此可以推测，通过改变肾小球前后微循环血管紧张度而从影响肾血流动力学以及肾小球滤过率[3].大量证据证明，法舒地尔在单侧输尿管梗阻、恶性高血压以及盐敏感高血压所致的肾小球硬化症等多种肾损伤模型中均可表现出肾保护作用；且已在相关肾疾病治疗中得到有效应用[3].然而，在造影剂引起的急性肾损伤这一临床常见并发症中，法舒地尔的保护作用尚未明确。因此，本研究建立造影剂肾损伤小鼠模型，并予2种不同剂量法舒地尔进行干预，通过检测小鼠血清肾功能和组织蛋白、观察组织病理切片等手段，验证法舒地尔对于减少造影剂诱导的急性肾损伤发生的作用，为临床应用提供理论依据。
　　
　　1材料与方法
　　
　　1.1材料 本研究采用6~8周龄，体重（25±2）g的BALB/C野生型实验小鼠，雌雄不拘，均由南京医科大学SPF级实验动物中心饲养（动物合格证号SYXK2013-0016）。动物中心内平均温度20℃，相对湿度50%~70%,12h光照维持，昼夜循环。全程颗粒饲料喂养，自由摄食、饮水，单笼饲养。
　　
　　1.2实验 试剂血清（浆）肌酐测定试剂盒（C011-2）、尿素氮测定试剂盒（C013-2）、尿β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（Nagase,NAG）测定试剂盒（A031）、糖原染色（PAS）试剂盒（D004）均购自南京建成公司，Tunel染色试剂盒购自罗氏公司。一抗试剂均购自美国CST公司。
　　
　　1.3造影剂导致的急性肾损伤小鼠模型建立 参照文献[4]报道方法，首先通过结扎小鼠一侧肾蒂，致单侧肾萎缩肾功能不全。术后1周，将小鼠按照随机数字表法等分为4组：等渗盐水对照组、造影剂肾病模型组（CM组）、造影剂+法舒地尔注射液低剂量组（LD组）和造影剂+法舒地尔注射液高剂量组（HD组）。禁水24h后，CM、LD、HD组小鼠按4gI/kg剂量经尾静脉注射碘克沙醇注射液，对照组小鼠注射等剂量等渗盐水。分别于注射造影剂前12、2h以及注射后4h按高剂量10mg/kg和低剂量3mg/kg分别予HD组小鼠和LD组小鼠腹腔注射法舒地尔注射液，模型组小鼠则注射相同剂量的等渗盐水。
　　
　　1.4检测指标
　　
　　1.4.1肾动脉血流 注射造影剂24h后，4组小鼠经3%戊巴比妥钠按40mg/kg剂量麻醉，胸腹部脱毛。通过小动物高频超声图像系统（Vevo 2100,Visualsonics,Canada,配备MS-400传感器/24MHz中心频率）检测小鼠右侧肾动脉直径（renal artery diameter,RAD）、血流速度-时间积分（velocity time integral,VTI）和HR,每项参数测量3次并记录平均值。测定后计算右肾动脉血流量（right renalarterial blood flow,RRBF），公式如下：
　　
　　RRBF=1/4×π×RAD²×VTI×HR1.
　　
　　4.2血清肌酐、尿素氮及尿NAG 将4组小鼠注射造影剂后置于代谢笼中，给予饮水不给饮食，收集24h尿液用于检测。按NAG检测试剂盒步骤检测NAG水平。将造影剂注射24h后的4组小鼠经3%戊巴比妥钠按麻醉后进行心尖采血。待血液凝固、血清析出后，用移液器吸取上层血清备用。按血清（浆）肌酐、尿素氮测定试剂盒步骤检测肌酐水平。
　　
　　1.4.3PAS染色及肾小管损伤评分 分别取4组小鼠肾固定，制成石蜡切片。经脱蜡、水化后按糖原染色试剂盒内说明书操作后封固，于显微镜下观察并拍照。每张病理切片在400倍显微镜镜下取左上、右上、中间、左下、右下各2个视野，共10个不重叠视野，观察肾小管损伤情况。观察上皮细胞肿胀，脱落坏死，空泡样变性，肾小管堵塞，肾间质充血、水肿、炎症细胞浸润及纤维化等情况，根据肾小管损伤范围进行评分[5].
　　
　　1.4.4TUNEL染色及蛋白免疫印迹检测 取4组小鼠肾固定，制成石蜡切片。经脱蜡、水化后按TUNEL染色试剂盒内说明书操作后封固，于显微镜下观察并拍照。将4组小鼠肾组织提蛋白，行蛋白电泳后，依次经转膜、封闭、一抗（Bax、Bcl-2、ROCK-1、ROCK-2、MYPT-1、pMYPT-1）孵育、漂洗、二抗孵育后显影。
　　
　　1.5统计学分析 所有数据采用均数±标准差（x±s）形式表示。使用SPSS21.0软件进行单因素方差分析和t检验，两两比较进一步采用SNK法。以P≤0.05为差异有统计学意义。
　　
　　2结果
　　
　　2.1法舒地尔改善碘克沙醇诱导的急性肾功能损伤 与对照组相比，CM组血清肌酐、尿素氮及尿液NAG浓度均显着升高（P<0.05）；与CM组相比，HD组血清肌酐、尿素氮水平显着降低（P<0.05）。LD组血清肌酐和尿素氮有降低的趋势，差异无统计学意义（P>0.05）；但与HD组之间差异有统计学意义（P<0.05）。同时与CM组相比，LD与HD组尿液NAG水平均显着降低，但不同剂量组间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1.
　　 　　
　　2.2法舒地尔减轻碘克沙醇对肾结构破坏 与对照组比较，CM组切片可见典型的造影剂损伤改变，显微镜下可见肾小管上皮细胞刷状缘消失、细胞胞质空泡样改变、肾小管扩张以及小管腔内蛋白管型的形成。HD组肾小管上皮细胞轻微肿胀，肾结构破坏明显减轻；而LD组较CM组有轻微好转，但肾结构的破坏仍然较为严重。见图1.
　　 　　
　　与CM组比较，HD组小鼠肾小管的损伤评分明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；LD组的评分虽有降低，但差异无统计学意义（P>0.05）。LD组高于HD组，差异有统计学意义（P<0.01）。见表2.
　　 　　
　　2.3法舒地尔改善碘克沙醇引起的肾动脉血流量减少 HD组较CM组RRBF显着升高，差异有统计学意义（P<0.05）。LD组RRBF虽然也有下降的趋势，但与CM组间差异无统计学意义（P>0.05）；与HD组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　
　　2.4法舒地尔改善碘克沙醇诱导的肾小管上皮细胞凋亡 与对照组比较，CM组肾组织切片中TUNEL染色阳性细胞数显着升高，见图2.与CM组相比，HD组阳性细胞数显着减少；LD组阳性细胞数轻微下降，差异无统计学意义（P>0.05），但与HD组间比较的差异有统计学意义（P<0.05）。见表2.
　　 　　
　　与对照组比较，CM组肾组织Bax蛋白表达水平显着升高；而Bcl-2表达水平组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。与CM组相比，高剂量法舒地尔治疗可显着降低Bax蛋白表达水平的同时显着上调抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达。LD组与CM组间差异无统计学意义（P>0.05）。LD与HD组在Bax蛋白表达水平差异无统计学意义；而在Bcl-2水平方面差异有统计学意义（P<0.05）。见图3.
　　 　　
　　2.5法舒地尔抑制碘克沙醇诱导的Rho/ROCK信号通路激活 ROCK-1蛋白表达水平在4组间差异无统计学意义。但与对照组比较，CM组的ROCK-2表达水平显着升高。HD组肾组织中ROCK-2的表达水平较CM组显着降低，差异有统计学意义（P<0.05），且与对照组间差异无统计学意义（P>0.05）。LD组ROCK-2水平也有明显下降趋势，但与CM组间差异无统计学意义（P>0.05）。高、低剂量组间ROCK-2表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。见图4.
　　
　　MYPT-1的表达水平在4组间差异无统计学意义。与对照组相比，CM组小鼠肾组织p-MYPT1水平明显升高（P<0.05）。HD组p-MYPT1表达水平较CM组显着降低；与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。LD组p-MYPT-1水平虽然较CM组有所降低，但两者间差异无统计学意义（P>0.05）。高、低剂量组间p-MYPT1表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。见图4.
　　 　　
　　3讨论
　　
　　近年来，动脉粥样硬化性心血管疾病（arteriosclerotic cardiovascular disease,ASCVD）的发病率逐年升高，心血管影像学诊断和介入治疗的应用也日益广泛，相关检查和介入术中均需要使用含碘造影剂。研究表明，碘造影剂对肾细胞具有一定的毒性作用，故可能会引起术后患者肾功能的急剧恶化；特别是在老年和本身具有基础肾疾病的患者中，其结果往往会导致急慢性肾功能衰竭、肾功能功能永久性损伤需要长期的肾替代疗法甚至死亡[6-8].因此，造影剂引起的急性肾损伤受到临床广泛重视，然而大量临床研究表明，除水化方法外，其他有效治疗手段匮乏[9].
　　
　　为进一步研究造影剂引起的急性肾损伤发病机制，并探索新型治疗药物，本研究通过模拟临床情况，在保留单侧健肾的基础上建立了造影剂急性肾损伤的小鼠模型。通过与对照组小鼠比较，CM组小鼠的肾功能指标、肾结构病理学检测结果、肾血流动力学等方面均出现明显的损伤；且细胞凋亡和相关促凋亡蛋白的表达也显着改变，从而证实了该小鼠模型的可靠性和临床适用性，这也为今后临床造影剂引起肾损伤研究提供了较为可靠的实验模型。
　　
　　有文献报道，Rho/Rho激酶信号通路的激活在造影剂导致的肾损伤的病理过程中发挥重要作用[9].Rho激酶（ROCK）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ACG家族，是小GTP蛋白家族Ras同源物基因家族成员A（RhoA）下游重要的效应分子[10-12].ROCK分为2种亚型：ROCK-1和ROCK-2.其中在调节肾炎症和纤维化的方面，ROCK-2为发挥关键作用的分子。本研究结果显示，在注射造影剂的CM组小鼠肾组织中，ROCK-2的表达水平较对照组小鼠有显着升高，而ROCK-1表达水平差异则无统计学意义。同时，研究发现在CM组小鼠组织中，ROCK的重要下游分子p-MYPT1的表达水平显着升高。这表明造影剂肾病的发病机制可能与Rho/ROCK-2信号通路的激活和下游相关分子表达增加有一定联系。然而，法舒地尔是否通过抑制该信号通路而发挥其改善造影剂介导的肾损伤作用尚未明确。本研究结果进一步显示，法舒地尔可以降低ROCK-2和p-MYPT1蛋白分子的表达水平，从而改善造影剂导致的急性肾功能不全及肾结构的损害。生化检验结果提示，肾功能指标血清肌酐和尿素氮均显着下降；组织病理切片和糖原染色结果表明，小鼠肾小管的损伤评分明显降低；彩色多普勒检测发现，小鼠右肾动脉血流量明显改善，所有结果均一致证实大剂量法舒地尔具有增加肾总血流量，从而改善造影剂诱导的血管收缩反应和明显肾保护作用。但低剂量的法舒地尔并没有发挥充分的肾保护作用，因此在肾功能指标、肾损伤评分病理检测结果和肾血流多普勒检查结果中均未发现明显的改善作用。免疫印迹检测结果提示，低剂量法舒地尔组中ROCK-2和其下游pMYPT-1蛋白表达水平均无明显下降，故认为对ROCK-2及其下游蛋白分子的表达抑制不足是低剂量法舒地尔不能发挥肾保护作用的重要原因。
　　
　　肾小管上皮细胞的凋亡是造影剂导致急性肾功能衰竭的重要发病机制之一。有文献报道，ROCK的激活是导致细胞凋亡过程的重要因子之一[10-12].既往文献报道，在糖尿病大鼠模型中，法舒地尔可抑制Rho/ROCK通路的激活，从而减轻造影剂导致的肾小管上皮细胞的凋亡[13].本研究首先通过TUNEL染色检测肾组织切片中的凋亡细胞表达情况，并采用蛋白印迹方法分别检测了促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。Bcl-2和Bax是细胞凋亡中极其重要的调控因子[14-15].研究结果证明，高剂量的法舒地尔干预可以显着上调Bcl-2表达、降低Bax的表达水平，从而抑制细胞凋亡。因此，推测大剂量法舒地尔可充分抑制Rho/ROCK通路的激活，下调促凋亡蛋白表达的同时增加抗凋亡蛋白的表达，从而减少因造影剂诱发肾小管上皮细胞的凋亡，最终发挥肾保护作用。
　　
　　总之，本研究结果证明了Rho激酶抑制剂（法舒地尔）具有肾保护作用，并可通过减少细胞凋亡以及改善局部血流动力学紊乱减轻碘造影剂诱导的急性肾损伤；且法舒地尔的肾保护作用与充分抑制Rho/ROCK信号通路具有重要关系，这也为临床应用提供了一定的参考。今后，在动物模型中还需进一步延长观察时间，并在肾细胞模型中进一步探讨相关机制，使研究结论更具说服力。
　　
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