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白介素-8对SKOV3细胞系卵巢癌干样细胞特性的影响

添加时间:2017/12/12 来源:未知 作者:admin
特别重要的是,添加 rhIL-8的干细胞条件培养基明显上调肿瘤干细胞标志蛋白 CD133和 CD44表达.因此,我们的实验结果提供了清楚的证据表明 :IL-8能够直接导致 SKOV3细胞 CSLCs 特性获得
以下为本篇论文正文:
  【摘要】目的:研究白介素-8(IL-8)能否促成人卵巢癌SKOV3 细胞系细胞肿瘤干细胞样细胞特性.方法:用添加或未添加重组人 IL-8(rhIL-8 :10.0 ng/mL)的干细胞条件培养基处理 SKOV3 细胞.肿瘤球形成和琼脂集落形成试验测定球形成率和集落形成率.蛋白质印迹分析肿瘤干细胞标志蛋白 CD133 和 CD44 表达水平.结果 :rhIL-8(10.0 ng/mL)显着地增高 SKOV3 细胞肿瘤球形成率和琼脂集落形成率.此外,rhIL-8(10.0 ng/mL)上调 SKOV3 细胞CD133 和CD44 蛋白表达.结论:rhIL-8具有促进SKOV3 细胞肿瘤干细胞样细胞特性作用.
 
  【关键词】卵巢癌;肿瘤干细胞;白介素-8;自我更新 ;CD133 ;CD44

  肿瘤生物学领域的新理论推定具有干细胞样性质的细胞亚群,亦称为肿瘤干样细胞(Cancer stem-likecells,CSLCs)驱使肿瘤发生和演进[1].我们先前的实验结果证实 SKOV3细胞系球细胞具有 CSLCs 性质[2,3].有研究提示白介素 -8(IL-8)触发 STAT3信号传导活化与卵巢癌致瘤潜能和多药耐药关联[4,5].特别重要的是大量研究结果证实 IL-8参与肿瘤微环境与肿瘤干细胞交互作用,并能有效促成肿瘤干细胞特性[6-8].本文的研究目的在于检查和确定 IL-8与人卵巢癌 SKOV3细胞系细胞CSLCs 特性的直接联系.
 
  1材料与方法
 
  1.1试剂与细胞培养 重组人表皮生长因子(EGF,Invitrogen 公司,Carlsbad,CA,USA)、重组成纤维细胞生长因子(bFGF,Invitrogen 公司)、不含维生素 A 的 B27添加物(Invitrogen 公司)、牛血清白蛋白(BSA,Sigma-Aldrich 公司)、胰岛素(Sigma-Aldrich 公司)、Accutase 细胞分离溶液(德国 PromoCell 公司,)、DMEM/F12培养基(GIBCO 公司,500mL/ 瓶,保存于2~8℃)、鼠抗人β-actin 单克隆抗体源自美国 Santa Cruz Biotechnology,Inc. 公司(dilution,1:2000;cat. no. sc-7210;Santa CruzBiotechnology,Inc. Dallas,TX,USA);兔抗人 CD133多克隆抗体源自美国 Abcam,Inc. 公司(dilution,1:2000;no.ab66141;Abcam,Inc.Burlingame,CA,USA);兔抗人CD44多克隆抗体源自美国 Abcam,Inc. 公司(dilution,1:2000;no.ab41478;Abcam,Inc.Burlingame,CA,USA);辣根过氧化酶标记兔抗鼠 Ig G 二抗源自中国碧云天生物技术研究所(dilution,1:2000;cat. no. A0216;Beyotime Institute of Biotechnology,中国上海市);辣根过氧化酶标记山羊抗兔 Ig G 二抗源自中国碧云天生物技术研究所(dilution,1:2000;cat. no. A0239;BeyotimeInstitute of Biotechnology,中国上海市);增强化学发光检测试剂购美国 Amersham Pharmacia Biotech 公司(Piscataway,NJ,USA).人卵巢癌 SKOV3细胞系细胞购自中国科学院细胞中心(中国上海市).参照文献[2,3]描述的方法和步骤,维持细胞生长和进行球细胞培养.
 
  1.2球形成率测定 细胞用添加或未添加 rhIL-8(10.0ng/mL)的无血清干细胞条件培养基悬浮细胞,以2000个 /mL 的密度每孔0.5mL 接种于24孔超低粘附培养板,培养6天,计数每孔肿瘤球数.球形成率计算公式 :球形成率(%)= 每孔球均数 / 接种活细胞总数(1000个细胞)×100%.
 
  1.3琼脂集落形成率测定 取35mm 直径细胞培养皿,用含0.8% 琼脂糖的20% FBS(GIBCO 公司)DMEM/F12培养基每皿1.0mL 预先包被皿底,然后,配制含0.4% 琼脂糖和1000个细胞以及 rhIL-8(10.0ng/mL)添加或未添加 rhIL-8(10.0ng/mL)的无血清干细胞条件培养基的上层培养体系,每皿1.0mL 接种底层0.8% 琼脂糖之上.培养14天,计数每孔集落数.集落形成率计算公式 :集落形成率(%)= 每皿集落均数 / 接种活细胞总数(1000个细胞)×100%.
 
  1.4蛋白质印迹 参照先前发表文献[2,3]的方法和步骤完成蛋白质印迹分析.
 
  1.5统计学分析 各组实验数据录入 Spss20.0forwindows evaluation 软件建立数据库,用均数±标准差(x±SD)表示,采用 One Way ANOVA 方差分析 ;首先进行方差齐性检验,在方差齐性情况下,多组均数间比较采用 LSD 法,在方差不齐情况下,多组均数间比较采用Tukey's 检验.P<0.05为有统计学意义.
 
  2结果
 
  2.1IL-8增强卵巢癌SKOV3细胞系自我更新能力.图1显示 :与干细胞条件培养基培养的 SKOV3细胞比较,添加 rhIL-8(10.0ng/mL)干细胞条件培养基培养的SKOV3细胞球形成率增高(P<0.05).
 
  2.2IL-8促进卵巢癌SKOV3细胞琼脂集落形成能力.图2可见 :与干细胞条件培养基培养的 SKOV3细胞比较,添加 rhIL-8(10.0ng/mL)干细胞条件培养基培养的SKOV3细胞琼脂集落形成能力增强(P<0.05).
 
  2.3IL-8上调卵巢癌SKOV3细胞CD133蛋白表达.图3表明 :与干细胞条件培养基培养的 SKOV3细胞比较,添加 rhIL-8(10.0ng/mL)干细胞条件培养基培养的SKOV3细胞CD133蛋白表达明显上调(P<0.05).
 
 
  2.4IL-8增高卵巢癌SKOV3细胞CD44蛋白表达水平.图4展示出 :添加 rhIL-8(10.0ng/mL)干细胞条件培养基培养的 SKOV3细胞 CD133蛋白表达水平显着的增高(P<0.05).
 

 
  3讨论
 
  IL-8是一种具有促进中性粒细胞趋化和脱颗粒相关的促炎性趋化因子.该趋化因子激活两种细胞表面G 蛋白偶联受体(CXCR1和 CXCR2)下游多条细胞内信号通路.在肿瘤细胞,内皮细胞,浸润嗜中性粒细胞和肿瘤相关巨噬细胞,已鉴定 IL-8和 / 或其受体的表达明显增加,提示 IL-8可能是肿瘤微环境中重要调节因子.Tsuyada 等[7]
 
  报道乳腺癌细胞分泌多种细胞因子(包括 IL-8)激活乳腺癌相关成纤维细胞 STAT3,依次,乳腺癌相关成纤维细胞分泌趋化因子(CC 基序)配体2(CCL2)诱导乳腺癌肿瘤干细胞特征,构成一个"癌- 间质 - 癌"信号回路.然而,IL-8是否能直接促成卵巢癌SKOV3细胞系细胞 CSLCs 特性还有待实验研究验证.
 
  为了确定 IL-8是否与卵巢癌 SKOV3细胞 CSLCs 功能和特性直接因果性联系,我们通过对比检测在干细胞条件培养基中添加 rhIL-8和干细胞条件培养基处理的SKOV3细胞肿瘤球形成率和软琼脂集落形成率.结果证明 :rhIL-8显着地增强 SKOV3细胞体外致瘤性,包括CSLCs的自我更新和锚定非依赖性生长潜能.
 
  特别重要的是,添加 rhIL-8的干细胞条件培养基明显上调肿瘤干细胞标志蛋白 CD133和 CD44表达.因此,我们的实验结果提供了清楚的证据表明 :IL-8能够直接导致 SKOV3细胞 CSLCs 特性获得.本文的研究成果为深入研究肿瘤细胞、肿瘤干样细胞自分泌以及与肿瘤细胞或肿瘤干样细胞交互作用的肿瘤相关成纤维细胞或肿瘤相关巨噬细胞分泌 IL-8诱导卵巢癌CSLCs特性获得的分子机制提供了参考性依据.
 
  参考文献
 
  [1] Lupia M, Cavallaro U. Ovarian cancer stem cells: still an elusive entity?Mol Cancer[J].2017 Mar 20; 16(1): 64.
  [2]Ning Y, Luo C, Ren K, et al. FOXO3a-mediated suppression of theself-renewal capacity of sphere-forming cells derived from the ovariancancer SKOV3 cell line by 7-difluoromethoxyl-5, 4'-di-n-octyl genis-tein[J]. Mol Med Rep.2014, 9(5): 1982-1988.
  [3]Ning YX, Li QX, Ren KQ, et al. Cao JG.7-difluoromethoxyl-5, 4'-di-n-octyl genistein inhibits ovarian cancer stem cell characteristicsthrough the downregulation of FOXM1[J]. Oncol Lett.2014, 8(1):295-300.
  [4]Lee JM, Trepel JB, Choyke P, et al. CECs and IL-8 Have Prognosticand Predictive Utility in Patients with Recurrent Platinum-Sensitive-Ovarian Cancer: Biomarker Correlates from the Randomized Phase-2Trial of Olaparib and Cediranib Compared with Olaparib in RecurrentPlatinum-Sensitive Ovarian Cancer[J]. Front Oncol,2015, 5: 123.
  [5]Stronach EA, Cunnea P, Turner C, et al. The role of interleukin-8(IL-8) and IL-8 receptors in platinum response in high grade se-rous ovariancarcinoma[J]. Oncotarget,2015, 6(31): 31593-31603.
  [6]Liu H, Ren G, Wang T, et al. Aberrantly expressed Fra-1 by IL-6/STAT3 transactivation promotes colorectal cancer aggressive-nessthrough epithelial-mesenchymal transition[J].Carcinogenesis,2015,36(4): 459-468.
  [7]Tsuyada A, Chow A, Wu J, et al. CCL2 mediates cross-talk betweencancer cells and stromal fibroblasts that regulates breast cancer stemcells[J]. Cancer Res.2012, 72(11): 2768-2779.
  [8]Zhang CH, Xu GL, Jia WD, et al. Activation of STAT3 signal path-way correlates with twist and E-cadherin expression in hepatocellularcarcinoma and their clinical significance[J]. J Surg Res,2012, 174(1):120-129.

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