本综述为临床应用小檗碱与吴茱萸碱治疗肿瘤与2型糖尿病提供了新的思路， 从信号通路角度讨论了小檗碱与吴茱萸碱协同抗肿瘤的作用机制， 为临床抗肿瘤治疗奠定了理论基础。
以下为本篇论文正文：
摘要：黄连-吴茱萸药对最早出现在宋朝时期， 两者一苦一辛， 一降一升， 对消化系统具有良好的药理作用。现代研究表明， 该药对对包括胃癌在内的多种肿瘤具有良好的抗肿瘤活性， 但其有效物质基础与协同机制尚不明确。本文总结近10年文献， 详细阐述了黄连-吴茱萸药对及其主要单体间的抗肿瘤机制和协同作用机制， 文献研究发现该药对在治疗肿瘤与2型糖尿病靶点通路上的共通性。本综述为临床应用小檗碱与吴茱萸碱治疗肿瘤与2型糖尿病提供了新的思路， 从信号通路角度讨论了小檗碱与吴茱萸碱协同抗肿瘤的作用机制， 为临床抗肿瘤治疗奠定了理论基础。
关键词：小檗碱； 吴茱萸碱； 抗肿瘤； 机理； 协同；
黄连-吴茱萸药对 （简称“连萸药对”） 最早见于宋朝《太平圣惠方》中的茱萸丸， 由黄连、吴茱萸按1:1组成， 药对中的黄连具有清热燥湿、泻火解毒的功效；吴茱萸具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻的功效[1].两者药性一寒一热， 属寒热配对， 彼此间功能相互协调、制约， 共同调整肝胃、肝心、脾胃等的虚实、寒热、升降平衡[2], 常用作消化系统疾病的治疗。现代研究[3]表明， 连萸药对不仅仅局限于胃肠道疾病， 在糖尿病[4]、高血脂[5]、抑郁症[6]、肿瘤[7]和老年性疾病[8]等的预防与治疗方面的研究也有一定进展。小檗碱 （Berberine, BBR） 又称黄连素， 属于季铵型异喹啉类生物碱， 是黄连的主要有效成分之一。吴茱萸碱 （Evodiamine, EVO） 又称吴茱萸胺， 为吴茱萸的有效成分之一。BBR与EVO均为生物碱成分， 展示出多种药理活性。BBR在临床上常用来治疗腹泻、胃肠炎等消化道疾病， 近年文献报道其可有效治疗糖尿病[9]、高脂血症[10]等代谢性疾病， 有望对该老药进行二次开发并最终用于糖尿病等的治疗。EVO临床上常用来镇痛， 做利尿剂和发汗剂使用， 在临床上的应用未有更多的研究报道。BBR与EVO都具有多种抗肿瘤活性， 研究者通过大鼠结肠癌模型[11]、肝癌模型[12]验证了其抗肿瘤活性。但其作用机制仍没有明确的概述， 本文对连萸药对及其主要单体的抗肿瘤作用机制和靶点的研究现状进行综述， 探索BBR与EVO的协同抗肿瘤机制， 为其临床应用奠定基础。
1 黄连与吴茱萸配伍研究现状
黄连与吴茱萸配伍使用历史悠久， 两者配伍比例不同， 功效也不尽相同， 除经典方茱萸丸 （连-萸1:1或3:2） 、左金丸 （连-萸6:1） 外， 通过改变其比例， 还衍生出了变通丸、抑青丸、赤龙丹 （连-萸1:1） 、甘露散 （连-萸2:1） 、反左金丸 （连-萸1:6） 、戊己丸 （连-萸-白芍6:1:6） 、二宜散 （连-萸1:2或2:1） 等方剂， 可治疗多种与脾胃功能有关[13-14]的病症， 文献记载以左金丸与反左金丸居多[15].
1.1 连萸药对用于胃癌的治疗
连萸药对治疗胃癌的报道较为多见。胃癌是一种较为常见的消化道恶性肿瘤， 而中国是胃癌高发率及高死亡地区[16].连萸药对治疗胃癌， 其药理活性主要体现在抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡两个方面。
Bcl-2超家族包括抗凋亡成员Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w （由BCL2L2基因编码） 和促凋亡成员Bax、Bak、Bad等， 两类蛋白的表达平衡影响细胞的存亡[17].反左金丸水提物对胃癌SGC-7901细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用[18].进一步研究发现， 与反左金丸相比[19], 相同浓度的左金丸对SGC-7901细胞增殖的抑制作用更强， 凋亡特征更明显[20].另有研究者发现， 左金方对胃癌细胞诱导凋亡的作用优于单用黄连、吴茱萸， 可视为黄连与吴茱萸具有协同效应， 其作用主要通过下调Bax/Bcl-2比率[21]和降低细胞膜电位[22]来实现， 也可通过降低线粒体内跨膜电位诱导胃癌细胞凋亡， 且抑制效果强于单用黄连与吴茱萸[23].
1.2 连萸药对用于腹水型肉瘤、结肠癌、肝癌、肺癌的治疗
王晓娜等[24]对接种多药耐药S180腹水型肉瘤小鼠给予左金丸、黄连和吴茱萸治疗7 d后， 有效降低小鼠肝指数， 升高脾指数， 延长生存周期， 该作用左金丸组优于黄连、吴茱萸单独治疗组。研究表明左金丸可能是通过降低多药耐药细胞膜上P-gp的表达， 抑制抗肿瘤药物的外排， 从而增强抗肿瘤作用。董立等[25]在研究连萸药对 （1:1） 水提物对二甲肼诱发的大鼠结肠上皮细胞癌的影响中发现， 药对可以抑制结肠癌癌前病变异变肠腺病灶的形成， 并抑制二甲肼所致的结肠黏膜上皮增殖， 促进结肠上皮细胞凋亡， 呈现出剂量依赖性， 其作用多集中于肠腺中下部， 可能具有一定的空间选择性[26].
左金丸通过抑制转录激活因子 （activator protein 1, AP-1） 和核转录因子-κB （nuclear factor of kappa B, NF-κB） 通路从而抑制肝癌Hep G2细胞增殖[27].Xu等[28]探究左金丸对肝癌系SMMC-7721、BEL-7402、BEL-7404、Hep G2、肺癌系A549、NCI-H446、NCI-H460和结肠癌系HCT-116共八种癌细胞的作用发现， 左金丸对SMMC-7721、Hep G2和NCI-H460细胞有较好的抑制增殖作用， 可以将SMMC-7721和Hep G2细胞周期阻滞在G0/G1期， 将NCI-H460细胞周期阻滞在S期；通过免疫蛋白印迹观察到左金丸可以上调SMMC-7721、A549和HCT-116细胞中Bax和Bak蛋白水平， 同时降低Bcl-2和Bcl-XL蛋白水平， 通过单细胞凝胶电泳结果观测到左金丸可以激活caspase-3和caspase-9的表达从而诱导肿瘤细胞凋亡， 因而其抗癌机制可归于线粒体介导的细胞凋亡途径。
综上， 连萸药对可作为一种治疗胃癌、腹水型肉瘤、结肠癌、肝癌、肺癌等的潜在药物， 其抗肿瘤活性研究从胃癌开始， 逐步扩展到其他消化系统肿瘤， 再到非消化系统肿瘤， 其潜在抗肿瘤药理活性不断被发掘。其作用机制可能是线粒体介导的细胞凋亡途径， 通过激活Bax、Bak蛋白表达， 下调Bcl-2、Bcl-XL蛋白表达水平， 刺激caspase-3和caspase-9活性增强， 从而诱导细胞凋亡。
2 EVO与BBR抗肿瘤作用
EVO与BBR对多种肿瘤有药理活性， 抗肿瘤机制的研究多集中在细胞学和分子学基础上。其作用主要体现为抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡和减少肿瘤的恶性转化与转移等方面[29].
2.1 EVO的抗肿瘤作用
NF-κB参与调节多种基因的转录， 如细胞周期蛋白D1 （cyclin D1） 、C-Myc、环氧化酶-2、基质金属蛋白酶-9、细胞间粘附分子-1、生存蛋白、凋亡抑制蛋白、Bcl-2、Bcl-XL等[30].EVO对大多数肿瘤细胞都会引起NF-κB的抑制与失活。丝氨酸/苏氨酸激酶 （serine/threonine kinase, Akt） 是参与磷脂酰肌醇-3-羟激酶 （phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase, PI3K） 信号传导的主要效应分子， Akt的活化异常是各种复杂疾病 （含2型糖尿病和癌症） 的病理生理学特性的基础[31].
在胃癌、肝癌细胞系中， 表现为抑制细胞增殖。经caspase抑制剂干扰， EVO仍可抑制SGC-7901细胞增殖并诱导其凋亡， 表明其除激活caspase途径外还有其他通路可诱导细胞凋亡[32].EVO也可以通过下调Akt、低氧诱导因子、磷酸果糖激酶、PRPP合成酶和p53的表达， 影响特异糖代谢过程， 抑制肝癌Hep G2细胞增殖[33].
在乳腺癌、宫颈癌、黑色素瘤细胞系中， 机制主要是诱导细胞凋亡。EVO通过下调MMP-9, 抑制血管新生， 从而抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭；进而通过下调Bcl-2、细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白依赖性激酶-6的表达或上调Bax和p27的表达使细胞周期停滞在G0/G1期， 诱导细胞凋亡[34];EVO也可将人乳腺癌NCI/ADR-RES细胞周期阻滞在G2/M期[35].EVO在He La细胞内诱导DNA的寡核小体片段化， 在体外激活caspase-3, 并通过上调Bax/Bcl-2的比率促进细胞的凋亡[36].EVO作用于人黑色素瘤A375-S2细胞， 激活caspase-3, 增强Fas-L表达和促使Bcl-2裂解， 这些信号可通过泛素-蛋白酶途径增强[37].
在鼻咽癌、结直肠癌细胞系中， 多为抑制细胞迁移作用。EVO通过抑制p65亚基的移位可同时降低MMP-2的m RNA和蛋白质水平及其在人鼻咽癌NPC细胞中的活性， 同时强烈减弱ERK1/2磷酸化水平， 抑制癌细胞的迁移和侵袭[38].EVO通过调节p53信号通路诱导人结直肠癌HCT-116细胞凋亡， 也可通过下调胃蛋白酶原I抑制JAK2/STAT3通路减少MMP3的表达从而抑制细胞迁移[39].
以上研究表明， EVO对胃癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、人黑色素瘤、鼻咽癌、多发性骨髓瘤[40]、头颈部鳞状细胞癌[40]、白血病[40]、肺癌[41]、结肠癌[41]、大肠癌[42]等多种肿瘤细胞系都有抑制作用， 可作为肿瘤治疗的潜在药物。其作用机制主要体现在以下方面：通过抑制NF-κB激活、使Akt活性丧失抑制肿瘤细胞的增殖；激活caspase途径抑制肿瘤细胞的增殖并诱导凋亡；降低基质金属蛋白酶的表达水平抑制肿瘤细胞的迁移与侵袭。
2.2 BBR的抗肿瘤作用
研究发现， BBR对多种肿瘤细胞系都存在药理活性， 多表现为抑制细胞增殖、诱导凋亡等。
在肝癌、黑色素瘤细胞系中， 抑制细胞增殖作用较明显。Wang等[43]证实了BBR可以抗肝癌SMMC-7721细胞增殖， 将细胞阻滞在G0/G1期， 其机制可能是线粒体膜电位下降， 激活caspase3信号通路所致。低浓度的BBR集中在线粒体中， 将细胞周期阻滞在G1期；高浓度的BBR则作用于细胞质中， 将细胞周期阻滞在G2期， 并抑制DNA的合成， 从而抑制黑色素瘤细胞增殖[44].
在膀胱癌、胃癌、乳腺癌细胞系中， 诱导凋亡作用居多。BBR将人膀胱癌BIU-87和T24细胞周期阻滞在G1期；抑制原癌基因H-Ras及其下游基因c-fos的m RNA和蛋白质的表达， 通过激活caspase-3和caspase-9诱导肿瘤细胞凋亡[45].通过上调Bax/Bcl-2比率和野生型p53基因表达， BBR可以抑制人胃癌AGS[46]、SNU-5[47]细胞增殖， 并诱导其凋亡。BBR通过抑制COX-2作用和存活素表达水平， 诱导人类导管乳腺上皮肿瘤T47D细胞凋亡[48].BBR将MCF-7细胞周期阻滞在G0/G1期[50], 并通过增加细胞质细胞色素c、caspase-9活性和PARP切割水平， 降低Bcl-2水平诱导凋亡[49].BBR可通过抑制组织纤溶酶原激活物诱导的MMP-1和MMP-9 m RNA和其蛋白表达， 从而抑制人乳腺癌转移[51].
综上， BBR对肝癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌、淋巴瘤[52]、卵巢癌[53]等肿瘤细胞系都有药理活性。其作用机制主要体现在激活TNF诱导反应， 抑制NF-κB激活， 使Akt活性丧失， 破坏糖酵解过程等抑制肿瘤细胞增殖；激活caspase途径抑制肿瘤细胞增殖并诱导凋亡；上调Bax/Bcl-2比率和野生型p53基因表达诱导细胞凋亡；抑制MMP-1、MMP-3和MMP-9的蛋白表达抑制细胞迁移。
2.3 BBR与EVO协同抗肿瘤作用
在肝癌细胞系中， EVO和BBR均可抑制Hep G2细胞的增殖， 其机制可能是抑制AP-1或抑制NF-κB信号通路从而将细胞周期阻滞在G2期， 抑制肝细胞增殖[27].当EVO和BBR联合 （3:1） 使用时， 对肝癌SMMC-7721细胞的抑制率高达50.00%, 抗肿瘤效果明显强于单独使用EVO 20.24%和BBR 16.33%的抑制率[54].马超[29]先在细胞水平上确定了EVO与BBR两者的剂量范围及协同作用配比 （10:1） , 显示两者可协同抑制肝癌BEL-7402细胞增殖；而后在基因水平上采用RNA seq技术、基因富集和网络整合等手段对两者单独及联合作用于肿瘤细胞的差异基因进行图谱分析， 发现与其协同抑制肿瘤细胞增殖相关的差异表达基因有FZDl、GSK3B、CCNDl、GLIl、SOSl和AKT3.结果表明， 两者合用可通过下调NF-κB和AP-1基因表达， 从而调节细胞增殖或凋亡基因 （CCNDl和Bcl-XL） 的表达， 也可下调BCL2和BCL2L2基因表达从而抑制癌细胞增殖或促进细胞凋亡。同时， 推测EVO与BBR可能通过调节不同micro RNA的表达致使某些特异性m RNA翻译活性改变， 从而达到一定的协同效果。
在胃癌细胞系中， EVO对胃癌AGS细胞表现出抗增殖和抗迁移作用， 并有增加白细胞介素-8 （interleukin-8, IL-8） 表达和AGS细胞对内皮细胞的粘附能力的潜在倾向， 但在联合BBR治疗后抑制了其副作用。即IL-8被中和后， 由EVO诱导的增加AGS细胞粘附于人脐静脉内皮细胞作用被废除， 同时仍保持EVO抗肿瘤细胞增殖和抗迁移能力， 减少了胃癌细胞迁移或转移的风险[55].
在乳腺癌细胞系中， 吴焱等[56]验证了EVO与BBR联用能协同抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移， 可减少BBR的不良反应， 仍保持抗迁移的作用。Liu等[57]发现BBR和EVO可以反转大肠癌中被上调的mi R-429, 并增加钙黏蛋白和Par3的量， 抑制肿瘤细胞分化与迁移， 从而达到治疗癌症的目的。
目前的研究结果显示， EVO与BBR在治疗机制上， 具有一定的相似性， 都可激活caspase途径诱导肿瘤细胞凋亡， 推测其也可通过抑制AP-1或NF-κB信号通路发挥作用。EVO与BBR合用， 比例为3:1时对肝癌细胞有协同作用， 抑制肿瘤细胞增殖；比例为10:1时表达差异基因， 可能为其协同作用结果；EVO联合BBR治疗胃癌、乳腺癌时， 可抵抗由EVO引起的副作用， 仍保持抗增殖和抗迁移作用；两者合用治疗大肠癌时， 可下调mi R-429抑制肿瘤细胞迁移。EVO与BBR的抗肿瘤作用呈现出多靶点、多通路的特点， 尚有不明确的作用机制和靶点需要进一步研究。
3 连萸药对及其主要成分的临床应用
随着对连萸药对及其主要成分BBR和EVO在分子、细胞及动物水平的抗肿瘤作用研究的不断深入， 其与肿瘤治疗相关的临床研究报道逐步涌现出来。2016年张晓亮[58]的团队发现， 盐酸小檗碱单用或是联用扶正祛毒方治疗乳腺癌均有明显效果， 且联用效果优于单用；同年刘秀珍[59]的团队也发现， 盐酸小檗碱联用人参茎叶皂苷能明显提高患者的五年生存率， 降低乳癌手术复发及转移的概率， 并能提高乳癌患者术后生存质量， 与常规西药化疗相比无明显副反应。相关临床研究还有2001年由美国纪念斯隆-凯特林癌症中心发起的采用黄连提取物治疗实体肿瘤的I期临床试验以及尚未进行的另一项研究小檗碱治疗结直肠癌的II/III期临床试验[60].以上研究一方面证明了BBR抗肿瘤作用的临床应用前景以及与其他中药联合应用协同治疗肿瘤的潜在临床价值， 另一方面也表明连萸药对及其单体药最终应用于肿瘤的临床治疗尚须开展更多的临床研究。
4 讨论与展望
连萸药对及其主要成分BBR和EVO的抗肿瘤作用在分子、细胞及动物水平均有阐释， 主要涉及抗肿瘤细胞增殖、诱导凋亡与抑制迁移和侵袭三个方面。 （1） 药对及两个单体都能调控NF-κB或AP-1通路；BBR与EVO参与调节PI3K-AKT通路；BBR还可参与激活Raf-1蛋白激酶发挥作用。在Akt受到抑制时激活GSK-3触发细胞凋亡， 但这一过程中GSK-3参与癌基因转化的机制仍然不清楚。 （2） 药对及BBR、EVO主要调控死亡受体和线粒体/细胞色素c介导的凋亡通路诱导细胞凋亡。 （3） EVO与BBR均可增加钙黏蛋白的表达， 减少MMP的表达， 抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭；间接抑制新生血管的生成， 阻止肿瘤的转移。
综上， EVO与BBR治疗肿瘤的具体机制可归纳为如图1所示。图1表明其作用机制具有多靶点、多通路的特点， 各通路间相互衔接， 互相作用， 搭建起肿瘤治疗通路网络中的一部分。由图可见， EVO和BBR配伍抑制Akt激活， 抑制肿瘤细胞增殖；同时Akt靶点下游信号GSK3β也可以调节糖代谢功能[61-63], 可能为2型糖尿病的潜在靶点， 与Wnt1通路也有一定联系。但EVO和BBR配伍， 其相关变化机制仍然有不明确的地方， 还需要进一步的基础研究， 为临床应用提供参考依据。
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